コンビニ・エバポ第22弾

ユーザーズボイス

同じ時間に集めたサンプルを同時に処理できることで、変性を防ぐことができました!!

今回は、メタボロミクスの基礎的研究を行っている冨田様にお話を伺って参りました。
(インタビュー先:福岡大学 薬学部 機器分析学教室 助教 冨田 陵子 様)
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菊地
本日は宜しくお願い致します。それでは冨田先生のご研究内容を教えて頂けますでしょうか?
冨田様
私たちはメタボロミクスによる培養細胞状態の評価に関する基礎的研究を行っており、現在は、細胞培養培地中のアミノ酸をターゲットに測定を行っています。
菊地
ご研究ではどのような目的のため濃縮されているのでしょうか?
冨田様
アミノ酸などの細胞内の低分子代謝物の中には、濃度が低い為、LC-MS/MSでも検出できないものもあります。
そこで濃度を上げて検出可能とする為に、サンプルを濃縮しています。
菊地
濃縮する前はどのような作業をされているのでしょうか?
冨田様
培養細胞内の微量な低分子代謝物を有機溶媒と水の混合液で抽出しており、その後にコンビニ・エバポC10を用いて濃縮を行っています。
菊地
抽出後に濃縮を行う有機溶媒の種類やその容量はどのようなものでしょうか?
冨田様
60%~80%程度のメタノール溶液やアセトニトリル溶液で、それぞれ容量800µLをポリプロピレン製の1.5mLサンプルチューブを利用し乾固させています。
菊地
水が含まれているサンプルを濃縮されるようですが、温度は何℃に設定されていますでしょうか?
冨田様
なるべく早く溶媒を飛ばしたいので50℃設定にしており、これまでの経験からサンプルの遊離アミノ酸には、熱の影響がない温度設定だと考えています。
菊地
実際に水・メタノールや水・アセトニトリルを飛ばす際のサンプル検体数や作業時間を教えて頂けますでしょうか?
冨田様
まず、実験系全体でみると数日間かかります。
具体的には、細胞内の代謝物濃度を経時的に測定するため、だいたい24時間ごとにサンプルを集めており、抽出に30分、濃縮は1日1回4~6検体を2~3時間程度となります。この作業を数日かけて約5回繰り返し行っております。
菊地
作業に数日間を必要とすることから、一つの作業の時間を短縮することが求められていたのでしょうか。
コンビニ・エバポ導入以前の作業はどのような状態だったのでしょうか?
冨田様
これまでは窒素ガスの吹き付けによる乾固を行っていました。
現在と同じ容器を用いていましたが、1~2検体ずつ分けて処理していましたので、全検体を済ませるにはとても長い時間がかかっていました。そのことからも試料前処理の操作として「濃縮」を取り入れることに対して抵抗がありました。
菊地
窒素ガス吹き付けの方法では今と同じように4~6検体を同時には処理ができないタイプの装置だったのでしょうか?
冨田様
いいえ。窒素ガス吹き付けは、アルミブロックタイプで9検体セットが可能な装置でした。
ただ、窒素ガスの流量が多くなり消費が早くなること、吹き付けている間に室温で数時間~半日置いている状態となり、何らかの変性を起こすリスクがあったため、最大9検体の処理が可能であっても1~2検体ずつを短時間で乾固させる操作を繰り返すようにしていました。
菊地
なるほど。サンプルへの変性リスクを減らすための1~2検体ずつに分けた処理方法が、時間のかかる要因となってしまったのですね。現在、抵抗は解消されましたでしょうか?
冨田様
はい。水を含んでいる試料でも、それほど濃縮する時間がかからず、窒素ガスの消費量も気にすることなく、気兼ねなく自由に作業できています。
時間を決めてサンプルを集め、経時的な変動を評価するのですが、これまでの方法では、抽出~濃縮までの過程でサンプル間に時間的なバラツキが生じる懸念がありましたが、コンビニ・エバポC10では4~6検体を同時処理でできることから重宝しています。同じ時間に集めたサンプルを一度に同じ条件で濃縮できる点が良いところだと感じています。
現在、濃縮したサンプルをLC-MS/MSで測定し、約20種のアミノ酸を検出できていますので、濃縮方法を変えたことで、検出できなくなったり、未知ピークがクロマトグラム上に大きく出現するといったことも特にありませんでした。
菊地
コンビニ・エバポの濃縮原理でもLC-MS/MSの測定に影響を与えず、前処理で濃縮することの抵抗が無くなり、大変光栄です。
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菊地
実際に初めてコンビニ・エバポを知った際の感想など、教えて頂けましたら幸いです。
冨田様
最初は代理店さんからのチラシ紹介や学会での機器展で知りました。
水を含む溶液でさえ揮発させにくいイメージが強くありましたが、「DMSO溶液も飛ばせる」というような記載を見て、すごく便利そうだな…と感じました。
当初は1検体モデルのみだったため、自分の研究で利用したい!という考えには至りませんでしたが、多検体モデルが販売されたことから研究室の他の先生と相談して購入しました。
菊地
水、DMSOといった高沸点溶媒を飛ばせることは、多くの研究者様にとって魅力的に映るのだと存じます。本日は貴重なお話をありがとうございました。これからも宜しくお願い致します。
冨田様
ありがとうございました。これからも宜しくお願い致します。

取材者のコメント

アミノ酸をターゲットにLC-MS/MSで検出させる際の濃度を上げる必要があった冨田様は、サンプルの経時的な変動を評価するため、濃縮中のサンプルの変性が一番避けたい点でした。これまでは処理したいサンプル数が4~6検体だった場合に1~2検体ずつに分け、さらに数回繰り返しする必要があったため、時間がかかり過ぎることから濃縮に抵抗がありました。そのような課題に対して、コンビニ・エバポC10を用いることで、同じ時間に集めたサンプルを一度に同じ条件で濃縮できるようになり、水を含んでいても素早く処理して、サンプルの変性を防ぐことができました。
また、濃縮方法を変えてもLC-MS/MS測定において検出できなくなったものがあったり、未知ピークが出現することもなく、濃縮作業の効率化が実現できた良い事例となりました。

(取材担当:菊地)

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